Mai Thu Huyền xuất thân trong một gia đình có truyền thống nghệ thuật. Bố và cậu đều là nhà quay phim, hai dì là diễn viên xiếc và kịch nói. Năm 1994, Mai Thu Huyền giành giải nhất cuộc thi Học sinh thanh lịch toàn thành phố Hà Nội. Năm 1995, cô có vai diễn đầu tiên của mình trong bộ phim truyền hình "Nỗi đau thầm lặng" của nữ đạo diễn Đức Hoàn.

Cô đã tham gia hơn 30 vai diễn khác nhau trong nhiều bộ phim điện ảnh cũng như truyền hình, và đã đạt đến đỉnh cao sự nghiệp sau khi đảm nhận vai Trúc trong phim truyền hình "Những ngọn nến trong đêm" năm 2001. Các phim tiếp theo có Mai Thu Huyền tham gia: "Tia nắng mong manh" (2004), "Minh Nguyệt" (2006), "Nhà có ba chị em" (2007), "Bước chân hoàn vũ" (2009), "Lối rẽ" (2010), "Đời như tiệc" (2013), "Những kẻ hai mặt" (2014), "Những ngọn nến trong đêm phần 2" (2015), "Mãi mãi là bao lâu" (2016), "Ngày mai bình yên" (2018), "Kẻ tàng hình" (2019) ...

Trong chương trình Doanh nhân & Cuộc sống, Mai Thu Huyền chia sẻ những ngày tháng bị kẹt bên Mỹ do Covid-19 và những dự án cô ấp ủ nhiều năm qua.

Khi được hỏi về phim Kiều, một bộ phim tốn nhiều giấy mực của báo chí thì Mai Thu Huyền không ngần ngại chia sẻ: Có thể tư duy làm phim của tôi chưa theo số đông thị hiếu khán giả. Nhưng một bộ phim hay chưa chắc đã phải là bộ phim có doanh thu cao mà nó là bộ phim được hội đồng chuyên môn trong và ngoài nước đánh giá cao và ghi nhận về chất lượng.

Mai Thu Huyền cũng chia sẻ về kế hoạch làm phim trong thời gian sắp tới cũng như nhiều dự định trong năm 2023.